La Bibliothèque est fondée en même temps que l'Académie et collège de Genève créés en 1559 par les autorités genevoises même si sa première attestation est légèrement plus tardive (Bibliothèque en 1562); deux décennies auparavant, le dépôt légal, qui jouera un rôle important dans sa politique d'acquisition, a été instauré à Genève (1539, renouvelé en 1827, aboli en 1907 puis réintroduit en 1967). L'institution intègre les combles des bâtiments de l'Académie à Saint-Antoine où elle restera jusqu'au dernier quart du 19e s. (actuel collège Calvin, rue Théodore-de-Bèze).
Elle devient "Bibliothèque publique" en 1702, puis "Bibliothèque publique et universitaire" (1907-2006), enfin, "Bibliothèque de Genève" en 2006. A partir de 1702, la Bibliothèque publique développe un cabinet de curiosités. A la fin du 18e s., ses collections comprennent des livres, mais aussi des œuvres d'art (tableaux, gravures et sculptures), des objets scientifiques (physique, mécanique), des monnaies et médailles du mobilier, de l'horlogerie, des objets archéologiques et ethnographiques ainsi que des pièces relevant de l'histoire naturelle.
Aux 19e et au 20e siècles, la Bibliothèque perd une partie de ses collectons qui sont transférées dans les nouvelles institutions créées à cette époque. Le Musée académique créé en 1820 reçoit les pièces d'histoire naturelle, les antiquités et les objets ethnographiques (conventions du 22.01.1820, du 15.07.1820 et du 15.01.1846), suivis par la collection de numismatique (convention de 1825). Des peintures, en échange d'autres tableaux, quittent la Bibliothèque pour le Musée Rath en 1843, dont les volets du célèbre retable de Conrad Witz (1444) et provenant de la cathédrale Saint-Pierre; l’institution le conservait depuis 1732 (autrefois stocké à l'Arsenal). La création du Musée archéologique en 1872 suscite le transfert d'autres objets au début de l'année 1873.
La gestion de la Bibliothèque de l'Académie est attribuée à Ville de Genève, constiuté en municipalité en 1942, par la Constitution cantonale de 1847. Vingt ans plus tard (1867), Ville et État de Genève décident d'édifier en bordure de la promenade des Bastions les bâtiments académiques lesquels doivent abriter, dans leur corps central, de l'Université de Genève, à charge du canton, et, dans ses ailes, à l'est, la Bibliothèque, et, à l'ouest, un musée d'histoire naturelle, deux institutions financées par la Ville. La réalisation des bâtiments académiques est confiée aux architectes Jean Franel, Joseph Collart et Francis Gindroz. Les travaux de construction de la Bibliothèque bénéfice en outre d'un legs de 100000 francs du mécène Gustave Revilliod. Entre le 24.04 et le 15.11.1872, 70 000 volumes environ sont déménagés de l'ancienne Académie situé en Vieille Ville dans les nouveaux locaux des Bastions, les collections faisant l'objet d'un nouveau catalogue.
Avec l'accroissement continu de ses collections, la Bibliothèque fait face aux problèmes lancinants de l'insuffisance de ses espaces de stockage qui amène à transformer le bâtiment originel. Une des opérations les plus importantes est réalisée entre 1936 et 1938 par les architectes Peyrot et Bourrit. Un concours d'architecture, remporté en novembre 2023 par le groupement d’architectes portugais VASSCO, ACE et d’ingénieur civil Adao da Fonseca – Engenheiros Consultores, Lda, est la première étape d'un projet de rénovation des bâtiments historiques et d'extension des espaces de la Bibliothèque qui devrait être réalisé ces prochaines années (projet dit LARNAGE).
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