La Bibliothèque est fondée pour servir de bibliothèque à l'Académie et au Collège de Genève créé en 1559 (première mention de la Bibliothèque en 1562); peu auparavant, le dépôt légal avait été instauré à Genève (1539, renouvelé en 1827, aboli en 1907 puis réintroduit en 1967). Elle intègre les combles de la nouvelle institution bâtie à Saint-Antoine dont les locaux sont aujourd'hui occupés par le collège Calvin à la rue Théodore-de-Bèze.
Elle devient "Bibliothèque publique" en 1702, puis "Bibliothèque publique et universitaire" (1907-2006), enfin, "Bibliothèque de Genève" en 2006.
A partir de 1702, la Bibliothèque publique développe un cabinet de curiosités. A la fin du 18e s., ses collections comprennent des livres, mais aussi des œuvres d'art (tableaux, gravures et sculptures), objets scientifiques (physique, mécanique), une collection de numismatique, du mobilier, de l'horlogerie, des objets archéologiques et ethnographiques, ainsi que des pièces relevant de l'histoire naturelle.
Au 19e et au 20e siècle, la Bibliothèque perd une partie de ses collectons qu sont transférées dans de nouvelles institutions. Le Musée académique créé en 1820 reçoit les pièces d'histoire naturelle, les antiquités et les objets ethnographiques (conventions du 22 .01.1820, du 15.07.1820 et du 15.01.1846), suivis par sa collection de numismatique (convention de 1825). Des peintures, en échange d'autres tableaux, quittent la Bibliothèque pour le Musée Rath en 1843, dont les volets du célèbre retable de Conrad Witz provenant de la cathédrale Saint-Pierre que l’institution conservait depuis 1732 (autrefois à l'arsenal). La création du Musée archéologique en 1872 suscite le transfert d'autres objets au début de l'année 1873.
La gestion de la Bibliothèque de l'Académie est attribuée à Ville de Genève par la constitution en 1847. En janvier 1867, Ville et État de Genève décident d'édifier en bordure de la promenade des Bastions les bâtiments académiques lesquels doivent abriter dans le corps central de l'Université de Genève, à charge du canton, et, dans les ailes, la Bibliothèque, à l'est, et un musée d'histoire naturelle, à l'ouest, l'une et l'autre financés par la municipalité. La réalisation de l'ensemble est confiée aux architectes Jean Franel, Joseph Collart et Francis Gindroz. Les travaux de construction de la Bibliothèque bénéfice du legs de 100 000 francs fait par Gustave Revilliod. Entre le 24.04 et le 15.11.1872, 70 000 volumes environ sont déménagés de l'ancienne Académie situé en Vieille Ville dans les nouveaux locaux des Bastions, les collections faisant l'objet d'un nouveau classement et d'un nouveau catalogue.
Avec l'accroissement continu des ses collections, la Bibliothèque fait face à un problème lié à l'insuffisance de ses espaces de stockage qui amène à transformer le bâtiment originel. Une des opérations les plus importantes est réalisée entre 1936 et 1938 par les architectes Peyrot et Bourrit. Un concours d'architecture, remporté en novembre 2023 par le groupement d’architectes portugais VASSCO, ACE et d’ingénieur civil Adao da Fonseca – Engenheiros Consultores, Lda, est la première étape d'un projet de rénovation des bâtiments historiques et d'extension des espaces de la Bibliothèque qui devrait être réalisé ces prochaines années (projet LARNAGE).
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